Изменение липидома эпителия шейки матки при ВПЧ-ассоциированных поражениях в результате применения активированной глицирризиновой кислоты в форме спрея 0,1%

¹ Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В. И. Кулакова Министерства Здравоохранения Российской Федерации, 117997, Москва, Российская Федерация
² Институт Энергетических Проблем Химической Физики им. В. Л. Тальрозе Федерального Исследовательского Центра Химической Физики им. Н. Н. Сеченова Российской Академии Наук, 119334, Москва, Российская Федерация

РЕЗЮМЕ
Цель исследования.
Изучение особенностей липидного состава эпителия при ВПЧ-ассоциированных «малых» неопластических поражениях шейки матки на фоне применения активированной глицирризиновой кислоты.
Материалы и методы.
В проспективное когортное исследование были включены 80 ВПЧ-позитивных пациенток в возрасте от 18 до 49 лет: группа I (n=40) - хронический цервицит, ассоциированный с персистенцией ВПЧ и группа II (n=40) – LSIL и положительный тест на ВПЧ. Все пациентки получали Эпиген интим спрей 0,1% (действующее вещество – активированная глицирризиновая кислота) в течение 18 месяцев по протоколу. Липидный экстракт цервиковагинальной жидкости анализировался методом ВЭЖХ-МС/МС в четырех временных точках (до начала терапии, 6, 12 и 18 месяцев). Липиды идентифицировали с использованием R-скрипта Lipid Match и по характерным тандемным масс-спектрам (МС/МС). Различия в липидном составе ЦВЖ в группах 1 и 2, применявших глицирризиновую кислоту, определяли с помощью теста Манна-Уитни. Влияние на липидом элиминации ВПЧ и улучшение цитологической картины исследовали с помощью корреляционного анализа по Спирмену.
Результаты.
Динамический мониторинг липидного состава ЦВЖ методом ВЭЖХ-МС проводился у 40 пациенток с исходным диагнозом ВПЧ-ассоциированный хронический цервицит, и у 40 пациенток – LSIL (временные точки – 0, 6, 12 и 18 месяцев). После проведенной терапии в группе пациенток с хроническим цервицитом выявлена отрицательная корреляция с временем применения активированной глизирризиновой кислоты (Эпиген Интим спрей) для 13 липидов ЦВЖ, которые преимущественно относились к церамидам и фосфатидилхолинам. Изменение цитологического заключения в группе LSIL на NILM после применения препарата ассоциировано со статистически значимым снижением уровня группы липидов с подавляющим преобладанием церамидов – шесть из семи липидов (Cer-AS d28:1/16:0, Cer-BS d26:1/18:0, Cer-NS d18:1/26:0, HexCer-AP t18:0/24:0, HexCer-AP t18:0/26:0). Также статистически достоверное снижение уровня в течение всего периода применения препарата было выявлено для Cer-NS d20:1/26:0 и PE O-18:1/18:1. Таким образом, в результате локального применения препарата активированной глицирризиновой кислоты происходит изменение метаболических процессов в эпителии шейки матки. В частности, под действием глицирризиновой кислоты различия в глицерофосфолипидном метаболизме клеток эпителия у пациенток с цервицитом и LSIL становятся более явными. Такие же различия отмечаются при сравнении ЦВЖ пациенток с цервицитом при уменьшении количества типов ВПЧ.
При улучшении цитологической картины у пациентов с LSIL наиболее выраженные изменения связаны с метаболизмом сфинголипидов. Выявленное снижение уровня церамидов в результате применения препарата спрей Эпиген Интим подтверждает подавление воспалительной реакции в эпителии под действием глицирризиновой кислоты.
Заключение.
Полученные результаты позволяют уточнить механизм действия препарата спрей Эпиген Интим на эпителий шейки матки при «малых» неопластических поражениях. Изменения в метаболизме глицерофосфолипидов, сфинголипидов и церамидов способствуют снижению воспалительных и апоптотических процессов, элиминации ВПЧ и улучшению цитологической картины.
Ключевые слова: неопластические поражения, рак шейки матки, липиды, активированная глицирризиновая кислота, спрей эпиген интим

Вклад авторов:
Стародубцева Н.Л., Чаговец В.В., Назарова Н.М., Довлетханова Э.Р., Абакарова П.Р., Токарева А.О., Новоселова А.В., Кукаев Е.Н., Франкевич В.Е., Сухих Г.Т.
Концепция и дизайн исследования –Назарова Н.М., Франкевич В.Е., Стародубцева Н.Л., Сухих Г.Т.
Сбор и обработка материала –Чаговец В.В., Назарова Н.М., Довлетханова Э.Р., Новоселова А.В., Кукаев Е.Н.
Статистическая обработка данных – Токарева А.О., Чаговец В.В., Новоселова А.В.
Написание текста – Стародубцева Н.Л., Назарова Н.М., Довлетханова Э.Р., Абакарова П.Р., Токарева А.О., Кукаев Е.Н.
Редактирование – Назарова Н.М., Франкевич В.Е., Стародубцева Н.Л., Сухих Г.Т.

Введение

Вирус папилломы человека (ВПЧ) является наиболее распространенной инфекцией, передаваемой половым путем среди молодых женщин, и играет важную роль в развитии рака шейки матки^1,2. Поражения шейки матки в виде цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN) – это наиболее частое заболевание, ассоциированное с данным вирусом, являющееся предвестником канцерогенеза³. Персистенция вируса с длительной активной экспрессией вирусных онкобелков инициирует многостадийный процесс, в результате которого клетки эпителия шейки матки претерпевают изменения, способствующие опухолевой прогрессии^{4, 5}.

A. Farooqui и соавт. (2017) изучали влияние глицирризина на линию раковых клеток шейки матки HeLa⁶. Анализ жизнеспособности клеток показал, что воздействие глицирризина на клетки HeLa значительно снижало жизнеспособность раковых клеток шейки матки в зависимости от времени и дозы. Было продемонстрировано, что глицирризин оказывает цитотоксическое действие на раковые клетки шейки матки без значительного влияния на нормальные клетки. Результаты позволили установить, что глицирризин проявлял антипролиферативные и апоптотические свойства в отношении раковых клеток шейки матки, вызывая разрушение митохондриального мембранного потенциала, увеличение генерации АФК, активацию каспаз как внешнего, так и внутреннего пути гибели клеток, а также индукцию остановки клеточного цикла в фазе G0/G1.

В исследовании Valencia M.H. и соавт. (2011) была изучена эффективность глицирризиновой кислоты в терапии плоскоклеточных внутриэпителиальных поражений низкой степени (low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL) и инфекции вируса папилломы человека (ВПЧ) на примере 62 пациенток, средний возраст которых составил 27,8±9,5 лет. Все пациентки были ВПЧ-инфицированными, 40% из которых имели LSIL. Глицирризиновая кислота применялась внутрь в сочетании с местной терапией (спрей), контроль эффективности лечения проводился каждый месяц с помощью оценки зоны поражения при кольпоскопии и проведения ПАП теста (Pap-smear test, тест Папаниколау). Состояние пациентов нормализовалось через 4 недели от начала лечения, а улучшение было достигнуто у большинства пациентов через 12 недель (74%) (P <0,001) [7].

В другом клиническом исследовании было показано, что применение препарата активированной ГК (0,1%-ный спрей, Эпиген Интим) у пациенток с бессимптомным носительством ВПЧ позволяет снизить риск образования CIN (цервикальных интраэпителиальных поражений) в 3,2 раза при нормальном составе и в 2,5 раза – при нарушениях состава вагинальной микрофлоры после коррекции эубиотиком. Таким образом, результаты представленных исследований дают основание рекомендовать топическое применение препарата спрей Эпиген Интим у пациенток с латентными формами папилломавирусной инфекции (ПВИ), как возможный метод профилактики неопластических процессов в шейке матки, в том числе рака шейки матки⁸.

Согласно результатам, полученным Шарогородской (2013), применение активированной глицирризиновой кислоты (спрея 0,1%) через 6 месяцев приводило к улучшению цитологической картины до нормы у 29% пациенток, что достоверно выше, чем в контрольной группе (3,2%)⁹.

Современные исследования патогенеза развития неопластической трансформации эпителия шейки матки сосредоточены на выявлении молекулярных изменений в клетках эпителия под действием ВПЧ с использованием молекулярно-биологических и постгеномных методов исследования (протеомики, липидомики, метаболомики). Высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) лидирует в метаболомных исследованиях и позволяет определить биомолекулярные профили, связанные со специфическим клеточным метаболизмом для уточнения биохимии патофизиологических изменений в клетках [10]. В отличие от геномики и протеомики, метаболомика дает наиболее четкую молекулярную картину фенотипа биологической системы, поскольку метаболиты являются конечными продуктами как транскрипции, так и трансляции генов. Исследование липидома клеток эпителия шейки матки и цервико-вагинальной жидкости (ЦВЖ) при ЦИН очень ограничены^12-14. Эти исследования подтверждают, что неопластическая трансформация клеток под действием ВПЧ тесно связана с метаболическим перепрограммированием и изменениям уровней липидов.

Целью данного исследования является оценка липидома цервиковагинальной жидкости при применении активированной глицирризиновой кислоты в проспективной когорте ВПЧ-позитивных женщин для снижения риска развития CIN.

Материалы и методы.

В пролонгированное исследование были включены 80 пациенток в возрасте от 18 до 49 лет (средний возраст 30±6 лет), обратившихся в научно-поликлиническое отделение ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России.

Критерии включения: возраст от 18 до 49 лет, ВПЧ высокого риска (ВР); интраэпителиальные поражения низкой степени тяжести (ВПЧ-ассоциированный хронический цервицит и LSIL), половая жизнь с презервативом в течение всего периода исследования, регулярный менструальный цикл, способность выполнять требования протокола, предоставление подписанного письменного информированного согласия на участие в исследовании.

Критерии исключения: беременность, период лактации, прием гормональной терапии, наличие острых воспалительных заболеваний, нарушение функции почек, печени, легких в стадии декомпенсации, наличие психоневрологических заболеваний.

Критерии невключения в исследование: выявление ИППП в период проведения исследования (гонореи, хламидиоза, трихомониаза, сифилиса, кандидоза, генитального герпеса) ; злокачественные новообразования органов репродуктивной системы; беременность и лактация; тяжелые соматические заболевания, онкологические заболевания, сахарный диабет, первичные и вторичные иммунодефицитные состояния; проведение системной или местной антибактериальной в течение 1 месяца до начала исследования; использование оральных контрацептивов во время текущего лечения; непереносимость назначаемых в исследовании препаратов.

Участники были разделены на две группы в зависимости от цитологического заключения: группа I (n=40) - хронический цервицит, ассоциированный с персистенцией ВПЧ и группа II (n=40) – LSIL и положительный тест на ПВЧ. Все пациентки получали местно активированную глицирризиновую кислоту интравагинально 3 раза в день 14 дней ежемесячно на протяжении 3 месяцев, затем перерыв 3 месяца, затем снова глицирризиновую кислоту в форме спрея 0,1% по той же схеме. Контрольные временные точки – до начала терапии и через 6, 12 и 18 месяцев в соответствии с клиническими рекомендациями Минздрава ведения пациенток. Комплексное обследование женщин включало сбор клинико-анамнестических данных, определение гинекологического статуса, цитологическое исследование, ВПЧ-типирование, липидомный анализ соскобов эпителия шейки матки. Цитологическая оценка мазков с шейки матки осуществлялась по системе Bethesda (2014г.).

Взятие биологического материала (соскоб эпителиальных клеток из зоны трансформации шейки матки и эпителия анальной области) для ВПЧ-типирования осуществляли в пробирки с физиологическим раствором. При выделении ДНК вируса использовали наборы «Проба ГС» («ДНК-Технология», Россия). Метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента с последующей сорбцией нуклеиновых кислот на твердом носителе, последующих отмывках сорбента и элюции ДНК с сорбента. Объем образцов после выделения составил 100 мкл. Амплификацию типоспецифических фрагментов ДНК вируса папилломы человека и человеческой ДНК (контроль адекватности взятия биоматериала) проводили с помощью комплекта реагентов для выявления, типирования и количественного определения 21 типа вируса папилломы человека методом ПЦР HPV «Квант-21» («ДНК-Технология», Россия). Амплификацию осуществляли в режиме “реального времени” на приборе «ДТ-964» («ДНК-Технология», Россия). Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле амплификации по каналам FAM, HEX, ROX и Cy5. Обработка результатов осуществлялась автоматически с помощью программного обеспечения к приборам.

Определение липидома образцов ЦВЖ проводили посредством ВЭЖХ-МС анализа экстракта липидов. Липиды экстрагировали с помощью модифицированного метода Фолча. Липидные экстракты анализировали на жидкостном хроматографе Dionex UltiMate 3000 (Thermo Scientific, Германия), соединенном с масс-анализатором Maxis Impact qTOF с ЭРИ источником ионов (Bruker Daltonics, Германия). Разделение образцов осуществлялось методом обращенно-фазовой хроматографии на колонке Zorbax C18 (150 x 2,1 мм, 5 мкм, Agilent, США) с линейным градиентом от 30% до 90% элюента В (раствор ацетонитрил/изопропанол/вода, 90/8/2 о/о/о, с добавлением 0,1% муравьиной кислоты и 10 ммоль/л формиата аммония) за 20 минут. В качестве элюента А использовали раствор ацетонитрил/вода (60/40, о/о) с добавлением 0,1% муравьиной кислоты и 10 ммоль/л формиата аммония. Скорость потока элюирования была 40 мкл/мин, объем инжектируемого образца – 3 мкл. Масс-спектры получали в режиме положительных и отрицательных ионов в диапазоне m/z 100-1700 со следующими установками: напряжение на капилляре 4,1 кВ для режима положительных ионов и 3,5 кВ для отрицательных ионов, давление распыляющего газа 0,7 бар, скорость потока осушающего газа 6 л/мин, температура осушающего газа 200 oC.

Липиды идентифицировали с использованием R-скрипта Lipid Match и по характерным тандемным масс-спектрам (МС/МС). Для статистической обработки результатов использовали скрипты, написанные на языке R. Статистический анализ, проводили с помощью теста Манна-Уитни. Для описания количественных данных использовали медиану (Me) и квартили Q1 и Q3. Величину порогового уровня значимости p принимали равной 0,05.

Результаты.

Для оценки эффективности препарата была произведена оценка встречаемости ВПЧ высокого и низкого риска в группах пациенток 1 и 2. В исходной точке пациенток с хроническим цервицитом преобладал ВПЧ высокого риска (ВР) 16 типа (38%). После применения местно активированной глицирризиновой кислоты в форме спрея 0,1% ВПЧ ВР элиминировал у 87.5% пациенток, а ВПЧ низкого риска (НР) – в 77% случаев.

В группе 2 (LSIL) также исходно наиболее встречаемым являлся ВПЧ ВР 16 типа (40%). После 18 месяцев применения препарата Эпиген Интим отмечалась элиминация ВПЧ ВР в 88%, и в 80% - ВПЧ НР.

При динамическом наблюдении пациенток с «малыми» поражениями шейки матки применение глицирризиновой кислоты способствовало улучшению цитологической картины в группе 2 в 62.5% случаев. В обеих группах не отмечено прогрессирования процесса до CIN 2+.

Проведен анализ липидома ЦВЖ 320 образцов от 80 пациенток с «малыми» поражениями шейки матки, ассоциированными с персистенцией ВПЧ в четырех временных точках - 0, 6, 12 и 18 месяцев при применении препарата Эпиген интим (действующее вещество – глицирризиновая кислота). В режиме положительных ионов было зарегистрировано 57 липидов, в основном относящихся к фосфтидилхолинам, триглицеридам (16 соединений) и церамидам (14 соединений). В режиме отрицательных ионов был зарегистрирован 31 липид, в основном относящиеся к фосфатидилхолинам (8), церамидам (11) и фосфатидилэтаноламинам (7).

При сравнении липидома ЦВЖ пациентов с хроническим цервицитом и пациентов с LSIL перед началом лечения были выявлено достоверное снижение уровня 10 липидов при развитии неопластического процесса в режиме положительных ионов (таблица 1, рисунок 1), семь из которых относились к триацилглицеролам; аналогичная картина обнаружена и в режиме отрицательных ионов для PC 16:0_18:1 и PE O-16:0/18:1 (рисунок 2).

Таблица 1. Статистически достоверные различия в уровнях липидов ЦВЖ в группе хронического цервицита по сравнению с LSIL до лечения, режим положительных ионов.

Рисунок 1 - Сравнение хроматограмм липидов ЦВЖ, специфичных для хронического цервицита (черный цвет) по сравнению с LSIL (розовый цвет) до лечения, режим положительных ионов.

Рисунок 2 - Сравнение хроматограмм органического экстракта ЦВЖ, при хроническом цервиците (зеленый цвет) и LSIL (розовый цвет) до лечения, режим отрицательных ионов. Приведены характерные масс-спектры специфичных липидов ЦВЖ в отрицательной моде: PC 16:0_18:1 и PE O-16:0/18:1.

В результате длительного местного применения активированной глицирризиновой кислоты произошли значительные изменения в липидном составе ЦВЖ как в группе хронического цервицита, так и в группе LSIL. Было выявлено статистически значимое повышение уровня фосфатидилхолинов и фосфатидилэтаноламинов и понижение уровня триглицеридов при развитии патологического процесса (рисунок 3, таблица 2).

Рисунок 3 - Пример хроматограмм липидов ЦВЖ с характерными масс-спектрами, специфичных для хронического цервицита (зеленый цвет) по сравнению с LSIL (розовый цвет) после лечения, режим положительных ионов.

Таблица 2. Статистически достоверные различия в уровнях липидов ЦВЖ в группе хронического цервицита по сравнению с LSIL после лечения, режим отрицательных ионов.

С целью определения липидов ЦВЖ, уровни которых изменились в ответ на применение Эпиген Интим, был проведен парный тест Манна-Уитни в каждом отдельном режиме ионов (положительном и отрицательном). В группе пациенток с хроническим цервицитом статистически значимо изменились уровни четырех липидов ЦВЖ, относящихся к глюкозилцерамидам, фосфатидилхолинам и кардиолипинам (таблица 3). Для всех этих липидов характерно снижение уровня в процессе применения активированной глицирризиновой кислоты. Следует отметить, что другим результатом длительного применения Эпиген Интим стала элиминация ВПЧ в эпителии пациенток.

Таблица 3. Уровни липидов, статистически значимо изменяющиеся при сокращении типов ВПЧ при лечении хронического цервицита в течение 12 месяцев глицирризиновой кислотой.

При сравнении липидного профиля ЦВЖ у пациентов с LSIL, для которых наблюдалось улучшение цитологического диагноза после 18 месяцев применения препарата Эпиген Интим, с использованием парного теста Манна-Уитни было выявлено 7 липидов со статистически значимым снижением уровней в ЦВЖ в режиме отрицательных ионов (рисунок 4), со значимым преобладанием церамидов (6 из 7 липидов). Среди данных семи липидов для Cer-NS d20:1/26:0 и PE O-18:1/18:1 обнаружено статистически достоверное снижение уровня в группе LSIL в течение всего применения спрея Эпиген Интим.

Рисунок 4 - Пример хроматограмм липидов, уровни которых статистически значимо (p<0.05) изменились в ЦВЖ в результате лечения спреем Эпиген Интим при улучшении цитологического диагноза, в образцах пациентки с LSIL до и хроническим цервицитом после лечения, режим отрицательных ионов.

Для пациентов с хроническим цервицитом и элиминацией ВПЧ, была обнаружена отрицательная корреляция 12 липидов, преимущественно церамидов и фосфатидилхолинов, со временем применения препарата спрей Эпиген Интим (таблица 4).

Таблица 4. Липиды, уровни которых коррелируют с временем с начала лечения для пациентов с цервицитом и сокращением типов ВПЧ.

Для пациентов с LSIL, с улучшением цитологического заключения на хронический цервицит, было выявлено наличие отрицательной корреляции HexCer-AP t18:0/26:0 со временем (R = -0.47, P = 0.03). Для пациентов, у которых помимо улучшения цитологического заключения выявлено сокращение числа типов ВПЧ, также была зафиксирована слабая отрицательная корреляции HexCer-AP t18:0/26:0 со временем. Кроме того, определялось повышение PC 18:0_18:2 (R=0.53, p=0.02) и PE O-16:0/18:1 (R=0.45, p=0.04) в ЦВЖ.

Обсуждение результатов.

Масс-спектрометрия является одним из основных инструментов для обнаружения биомаркеров патологических процессов, при этом основной акцент направлен на исследование липидов и других малых молекул в качестве маркеров онкологических заболеваний. Липидомика позволяет идентифицировать, характеризовать и количественно определять все известные виды липидов. Метаболизм липидов претерпевает резкие изменения при раке, когда синтез липидов резко возрастает для обеспечения новых клеток мембранами и энергией. При злокачественной трансформации клеток происходит переход от окисления липидов для энергетических нужд к липогенезу de novo. Таким образом кардинально меняется липидный состав клеток.

В данной работе впервые исследовался липидом цервиковагинальной жидкости при неопластической трансформации клеток эпителия при длительной терапии активированной глицирризиновой кислотой. ЦВЖ включает как продукты жизнедеятельности микроорганизмов нижнего отдела женского генитального тракта, так и фрагменты клеток эпителия. Неинвазивность забора ЦВЖ и богатый молекулярный состав позволяет использовать ЦВЖ для изучения механизмов злокачественного перерождения эпителия шейки матки при длительной персистенции ВПЧ, а также эффективности проводимого лечения, связанного с элиминацией вируса. В данной работе проведено пролонгированное исследование липидома ЦВЖ при применении глицирризиновой кислоты в течение 18 месяцев у пациенток с «малыми» поражениями эпителия шейки матки.

Обнаружено, что липидом ЦВЖ претерпевает значительные изменения при элиминации ВПЧ и улучшении цитологической картины, связанных с действием глицирризиновой кислоты. Необходимо выделить липид PE O-16:0/18:1, который характеризуется противоположными трендами изменения уровня со временем при хроническом цервиците и LSIL, который характеризовал различия в ЦВЖ между пациентами с диагнозами LSIL и хронический цервицит до начала применения препарата. Аналогично можно говорить о значительных изменениях уровня PC 16:0_18:1 в ЦВЖ при хроническом цервиците: статистически значимо более высокий уровень, чем при LSIL до лечения, сменился статистически значимо более низким после лечения. Также данный липид оказался маркером уменьшения числа ВПЧ при применении препарата спрей Эпиген Интим. Снижение уровня PC 16:0_16:0 в ЦВЖ пациентов хроническим цервицитом при применении ГК позволяет выделить его как маркер, характеризующий различия между ЦВЖ у пациентов с LSIL и хроническим цервицитом.

Становятся более явными различия в глицерофосфолипидном метаболизме клеток в эпителии шейки матки между пациентами с хроническим цервицитом и LSIL. Такие же различия проявляются при сравнении ЦВЖ пациентов с хроническим цервицитом при уменьшении количества типов ВПЧ. Улучшение цитологической картины у пациентов с LSIL явно связаны с метаболизмом сфинголипидов.

Для церамидов характерно возрастание их количества в клеточной мембране при активации кислой сфингомиелазы, которая происходит при наличии патогена (вирусного или бактериального). Увеличение числа церамидов в липидных рафтах приводит к активации процессов апоптоза. Ранее было обнаружено, что активированная глицирризиновая кислота обладает противовоспалительной активностью. Стоит отметить более высокий уровень глюкозилцерамидов при хроническом цервиците по сравнению с LSIL. Для некоторых РНК-содержащих вирусов, таких, как вирус гриппа и гепатита А, была показана взаимосвязь между уровнем глюкозилцерамидов и развитием вирусного заболевания, обусловленная изменением экспрессии глюкозилцерамидазы или глюкоцзилцерамид синтазы.

Таким образом, можно говорить о влиянии длительного применения препарата спрей Эпиген Интим на липидный состав ЦВЖ в случае «малых» неопластических поражений шейки матки. Так, обнаружено снижение воспалительных и апоптических процессов при элиминации ВПЧ и улучшении цитологической картины, связанное с изменениями в метаболизме глицерофосфолипидов, сфинголипидов и церамидов.

Заключение

Анализ липидного профиля методом масс-спектрометрии, позволяет уточнить действие глицирризиновой кислоты на эпителий шейки матки при «малых» поражениях, ассоциированных с персистенцией ВПЧ. В результате были выявлены и описаны липиды, играющих ключевую роль при улучшении цитологической картины и элиминации ВПЧ при «малых» поражениях эпителия шейки матки (ВПЧ-ассоциированный хронический цервицит и LSIL).

Динамический мониторинг липидного состава ЦВЖ методом ВЭЖХ-МС проводился у 40 пациенток с исходным диагнозом ВПЧ-ассоциированный хронический цервицит, и у 40 пациенток – LSIL (временные точки – 0, 6, 12 и 18 месяцев). В группе пациенток с хроническим цервицитом в ответ на лечение статистически значимо снизился уровень четырех липидов ЦВЖ, относящихся к глюкозилцерамидам (HexCer-NDS d20:0/26:0), фосфатидилхолинам (PC 16:0_18:1 и PC 16:0_20:4) и кардиолипину (CL 16:0_16:1_18:1_18:1), при сокращении типов ВПЧ. Для 13 липидов, которые преимущественно относились к церамидам и фосфатидилхолинам, обнаружена отрицательная корреляция липидов, со временем применения спрей Эпиген Интим. Улучшение цитологического диагноза в группе LSIL в результате применения спрея Эпиген Интим также ассоциировано со статистически значимым снижением уровня группы липидов со значимым преобладанием церамидов – шесть из семи липидов (Cer-AS d28:1/16:0, Cer-BS d26:1/18:0, Cer-NS d18:1/26:0, HexCer-AP t18:0/24:0, HexCer-AP t18:0/26:0), причем для Cer-NS d20:1/26:0 и PE O-18:1/18:1 обнаружено статистически достоверное снижение уровня в течение всего применения спрея Эпиген Интим. Для пациентов, у которых при лечении улучшился цитологический диагноз и уменьшилось число типов ВПЧ, была зафиксирована слабая отрицательная корреляции HexCer-AP t18:0/26:0 и положительная корреляция уровней PC 18:0_18:2 и PE O-16:0/18:1 в ЦВЖ со временем.

Показаны изменения метаболических процессов в эпителии шейки матки в результате лечения спреем Эпиген Интим. В частности, под действием глицирризиновой кислоты становятся более явными различия в глицерофосфолипидном метаболизме клеток в эпителии шейки матки между пациентами с цервицитом и LSIL. Такие же различия проявляются при сравнении ЦВЖ пациентов с цервицитом при уменьшении количества типов ВПЧ в ходе лечения. При улучшении цитологической картины у пациентов с LSIL наиболее явные изменения связаны с метаболизмом сфинголипидов. Выявленное снижение уровня церамидов в результате лечения спреем Эпиген Интим подтверждает подавление воспалительной реакции в эпителии под действием глицирризиновой кислоты.

Данное исследование уточняет механизм применения препарата Эпиген Интим на эпителий шейки матки при «малых» неопластических изменениях, в частности, снижение воспалительных и апоптических процессов при элиминации ВПЧ и улучшение цитологической картины, связанное с изменениями в метаболизме глицерофосфолипидов, сфинголипидов и церамидов.

Работа выполнена в рамках экспериментального научного исследования «Разработка и внедрение протоколов с учетом новых технологий в ранней и дифференциальной диагностике, прогнозирования риска развития ВПЧ-ассоциированных предраковых и онкологических заболеваний у женщин репродуктивного возраста» 121040600125-0.

Литература

• E. F. Dunne, E. R. Unger, M. Sternberg et al., “Prevalence of HPV infection among females in the United States,” Journal of the American Medical Association, vol. 297, no. 8, pp. 813–819, 2007.
• IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, Vol. 90; Human Papillomaviruses, International Agency for Research on Cancer, Lyon, France, 2007.
• Роговская С.И. Папиллома-вирусная инфекция у женщин и патология шейки матки: (руководство практикующего врача). М.:ГЭОТАР-Медиа, 2015. 144 с.
• Довлетханова Э.Р., Прилепская В.Н. Папилломавирусная инфекция. Теоретические и практические аспекты. – М.: Гэотар Медиа, Москва, 2018.- 88с.: ил. ISNB 978-5-9704-45-39-9.
• Kaufman R, Adam E, Vonka N. HPV-infection and cervical carcinoma. Clin. Obstet. Gynecol., 2013, 43(2): 363-380.
• A. Farooqui, F. Khan, I. Khan, I. A. Ansari. Glycyrrhizin induces reactive oxygen species-dependent apoptosis and cell cycle arrest at G0/G1 in HPV18+ human cervical cancer HeLa cell line. Biomedicine & Pharmacotherapy 97 (2018) 752–764.
• Valencia, M. H., Pacheco, A. C., Quijano, T. H., Girón, A. V., & López, C. V. (2011). Clinical response to glycyrrhizinic acid in genital infection due to human papillomavirus and low-grade squamous intraepithelial lesion. Clinics and practice, 1(4).
• Боровиков, И. О., Куценко, И. И., Кравцова, Е. И., & Булгакова, В. П. (2017). Место активированной глицирризиновой кислоты в лечении и профилактике ВПЧ-ассоциированных поражений шейки матки. Медицинский совет, (2).
• Шаргородская, А. В. (2013). Клинико-эпидемиологические особенности папиллома-вирусной инфекции у молодых женщин. Дисс. канд. мед. наук. М.
• Liu X, Locasale JW. Metabolomics: a primer. Trends Biochem Sci (2017) 42(4):274–84.10.1016/j.tibs.2017.01.004
• Walker H, Burrell M, Flatley J, Powers H. A metabolite profiling method for diagnosis of precancerous cervical lesions and HPV persistence. Bioanalysis (2017) 9(8):601–8.10.4155/bio-2017-0012
• Porcari A. M., Negrão F., Tripodi G.L., et al. Molecular Signatures of High-Grade Cervical Lesions. Frontiers in Oncology 2018; 8(April). doi:10.3389/fonc.2018.00099.
• Аттоева Д.И., Стародубцева Н.Л., Назарова Н.М., Токарева А.О., Чаговец В.В., Кукаев Е.Н., Франкевич В.Е., Сухих Г.Т. Поиск маркеров при ВПЧ-ассоциированных поражениях шейки матки методом хромато-масс-спектрометрии. Доктор.Ру. 2021; 20(8): 48–58. DOI: 10.31550/1727-2378-2021-20-8-48-58
• Некрасова М.Е., Чаговец В.В., Стародубцева Н.Л., Кононихин А.С., Салимова Д.Ф., Токарева А.О., Лагутин В.В., Наумов В.А., Назарова Н.М., Франкевич В.Е., Сухих Г.Т. Липидные маркеры неопластической трансформации эпителия шейки матки при заболеваниях, ассоциированных с вирусом папилломы человека. Акушерство и гинекология. 2018; 4: 64-70.